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簡介
制備高特異性、高效價(jià)的抗體是實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)，抗體質(zhì)量的高低將直接影響試驗(yàn)的成敗。通過不同方法制備的抗體往往與多種雜蛋白混雜在一起，為了獲得成分相對單一的抗體或?qū)⒖贵w用于特定的用途，就需要進(jìn)行抗體純化。從成分的角度分析, 抗體分子是一類蛋白質(zhì)分子，與其他蛋白質(zhì)一樣，它有一定的等電點(diǎn)、溶解度、荷電性及疏水性，可以用電泳、 鹽析沉淀或其他層析技術(shù)進(jìn)行分離、純化。
純化抗體通常用于直接檢測抗原。此時(shí)抗體標(biāo)記有一個(gè)易于鑒定的標(biāo)記物，用于結(jié)合和檢測所研究的抗原。在間接檢測抗原方法中，一抗不被標(biāo)記，而是用標(biāo)記的二抗(一種抗免疫球蛋白抗體)來檢測。一般而言，建議使用間接法。因?yàn)樵S多商家能夠提供可靠的標(biāo)記二抗，用間接法不僅省力，結(jié)果同樣可靠。盡管如此，有幾種方法需要標(biāo)記的一級抗體。例如，在免疫染色試驗(yàn)中，需要研究2個(gè)或2個(gè)以上抗原的相對位置時(shí)，常需要純化抗體并用不同標(biāo)記物標(biāo)記，這樣能比較它們的相對位置。此時(shí)使用間接法不合適。因?yàn)殚g接法是用標(biāo)記二抗來給未標(biāo)記的一抗定位。又如，有時(shí)一抗需要標(biāo)記，而該樣本中又有大量無關(guān)抗體，它們能干擾對一抗的檢測，此時(shí)用間接法也不合適。用鼠源性單抗對鼠組織抗原進(jìn)行定位時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)這種情況。此時(shí)需要純化一抗，并直接按下述方法進(jìn)行標(biāo)記。
多克隆抗體的純化
多抗的純化是一件比較簡單的事情，因?yàn)槿斯じ深A(yù)比較大，所以對實(shí)驗(yàn)者的操作依賴性較強(qiáng)。很多新手覺得這是一件比較復(fù)雜困難的工作，但是如果理解了原理，就可以自行改進(jìn)實(shí)驗(yàn)了。多抗純化方法比較多，過去有用鹽析法純化的，有用辛酸-硫酸銨沉淀的方式純化的，也有用冷酒精沉淀的方式純化的，也有后來的離子交換層析和Protein A,G,A/G純化的，但是在今天，市場上幾乎所有的抗體都是通過抗原親和純化得到的，與其它方法相比，抗原親和層析得到的抗體效率高、產(chǎn)量高、產(chǎn)品純、操作簡單。
步驟如下：
1、介質(zhì)的制備
2、抗原與填料的連接
3、連接效果的評估
4、多余位點(diǎn)的封閉
5、抗血清與beads的結(jié)合
6、非特異性結(jié)合的抗體的洗滌
7、洗脫
具體 操作與原理可以看看中國免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)網(wǎng)上的詳細(xì)講解。
技術(shù)
免疫親和純化是另一種可能需要純化抗體的技術(shù)。在這一技術(shù)中，抗體共價(jià)交聯(lián)到一固相基質(zhì)上，如交連的瓊脂糖或聚丙烯酰胺微球。常用的方法是，先將抗體純化，然后連接到通過化學(xué)方法激活而具有結(jié)合位點(diǎn)的微球上。此時(shí)，抗體的純化對實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。
試驗(yàn)
還有一種需要純化抗體的試驗(yàn)，是從多克隆抗血清中分離抗原特異性抗體。多克隆血清中含有復(fù)雜多樣的抗體，它不僅含有針對免疫原產(chǎn)生的抗體，還有血清的全部抗體。出于特定目的的需要，必須將抗原的特異性抗體分離出來。例如使用抗肽抗體時(shí)，需要分離出特異性識(shí)別肽段的抗體。通過純化能獲得特異性很高的抗體。純化抗體的另一用途是降低本底。幾乎在所有技術(shù)中，使用純化抗體都能降低非特異性本底。產(chǎn)生這種效果主要是因?yàn)橐环矫婺苋コ饘?shí)驗(yàn)誤差的污染蛋白，另一方面能精確控制實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生陽性信號的抗體量。使用純化抗體不會(huì)使本底增加，因此純化抗體可以作為所有免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)中降低本底的基本手段。
抗體的純化通常是濃縮抗體的最簡單方法。任何來源的抗體可以用蛋白A或蛋白G的純化方法來濃縮。
盡管純化抗體的方法較多，建議用蛋白A或蛋白G微球純化法作為最常用的方法。這種方法效率高，能為常用的實(shí)驗(yàn)方法提供足夠純化的抗體，而且隨著商品化的蛋白A和蛋白G基質(zhì)的出現(xiàn)，能將任何來源的抗體純化。抗體的純化也可采用傳統(tǒng)的色譜法，在某些情況下非常有用。這些方法包括DEAE離子交換色譜法、硫酸銨沉淀法及其他方法。但是用蛋白G或蛋白A親和柱法純化較其他方法簡單，并且純化效果是其他方法的數(shù)倍。 |
