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酶標記抗體的制備
發布日期:2016-06-16      瀏覽:8989
(一)酶標抗體的條件
1.純度高、含雜蛋白少,用IgG優于血清抗體,用Fab優于IgG。
2.特異性強 即抗IgG與IgG在免疫電泳上只有一條沉淀線,與IgG的全血清也只有一條沉淀線,這才算是特異性的單價抗體。
3.效價高 一般瓊脂擴散鑒定為1︰64以上才算合格。
(二)酶標記方法
1.交聯法 交聯法通常用的交聯劑是戊二醛,戊二醛商品大多為25%的水溶液,利用戊二醛分子上對稱的兩個醛基,分別與酶和蛋白質分子中游離的氨基、酚基等以共價鍵結合而進行標記。標記時應盡量采用新鮮純品,當戌二醛的OD235nm/OD280nm<3時,即為好的交聯劑。
戊二醛交聯法又分為一步法和二步法。 
⑴ 一步法:即把酶、戊二醛和抗體一起加入進行交聯。然后透析出過量的戊二醛而制備出具有高分子量的酶結合物。由于抗體分子量大(16萬),酶分子量小(4萬),抗體分子的氨基數比酶蛋白分子氨基數多得多,結果生成的抗體-戊二醛或抗體-戊二醛-抗體多而造成酶標物的活性小。一步法操作:①抗IgG-AKP的制備:將10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中,在冰浴中緩緩攪拌,盡量避免氣泡產生,完全溶解后,緩緩滴加1%戊二醛溶液4ml,使戊二醛的最終濃度為0.2%,移至室溫中靜置2h~3h后,以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去過量的戊二醛,4℃保存備用(也可保存于50%甘油中置低溫冰箱);②抗IgG-HRP的制備:將12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,緩慢攪拌下加入1%戊二醛溶液4mL,置室溫2h~3h,充分透析或以SephadexG25除戊二醛,小量分裝后保存于低溫冰箱,避免反復凍融。或冷凍干燥保存。 
⑵ 二步法:是先使酶與戊二醛反應,除去未反應的戊二醛,再使已“活化”的酶分子與抗體分子的氨基結合,最后加入少量的賴氨酸封閉被戊二醛激活的酶的殘基。二步法操作:將10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室溫放置18h,充分透析或以SephadexG25柱除去未反應的戊二醛。加生理鹽水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗體溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液,混合后4℃冰箱放置24h,加入0.1ml 0.2mol/L賴氨酸,置室溫2h,以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析,離心去沉淀,上清液即為酶結合物,再進一步以硫酸銨沉淀純化后應用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。
改良HRP二步標記法:取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液中,加入25%戊二醛0.1ml,37℃溫育2h后加入冰冷的分析純的無水乙醇2ml,2 500r/min離心沉淀10min~15min,傾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混懸,同上離心,傾去乙醇,將管倒置,使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液溶解,加入0.5ml~1ml 抗IgG抗體溶液(含抗體15mg左右),放在冰箱內過夜后,加KH2 PO4,使近中性即可應用。 
2.氧化法 采用過碘酸鈉,過碘酸鈉是強氧化劑,能將HRP的甘露糖部分(與酶活性無關的部分)的羥基氧化成醛基,然后與抗體的氨基結合,形成酶標抗體。 
(1)氧化法操作過程如下:將5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸鈉中,加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)無水乙醇溶液,在室溫中混合后,再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L過碘酸鈉(NaIO4),置室溫中輕攪30min,在溶液呈黃綠色時,加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液,在室溫中放置1h,使氧化反應中止,然后在4℃中對0.10Mol/L pH 9.5重碳酸鈉緩沖液透析,換液3次。在3ml HRP-醛基溶液中,加入5mg(溶于1ml的碳酸鹽緩沖液中),室溫置2h~3h,加入5mg氫化硼鈉(NaBH4),于4℃冰箱放置3h或過夜,然后用PBS液充分透析,離心去沉淀物。上清液即為酶結合物,純化后使用。
(2)改良過碘酸鈉法:①取5mg HRP溶于0.5ml雙餾水中,加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml雙餾水+128mg NaIO4) 0.5ml,混勻,置4℃30min;② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml,室溫放置30min;③加入含5mg純化抗體的水溶液1ml,混勻,并裝入透析袋,對0.05Mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌透析6h(或過夜),使之結合;④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml,混勻,置4℃2h;⑤在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液,混勻,4℃30min,離心,去上清,沉淀以少許0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解,裝入透析袋,以同樣液體在4℃透析除鹽過夜;⑥次日取出離心,以除去不溶物,即得酶-抗體(HRP-IgG)結合物,以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml;⑦效價測定合格后,加入等量優質甘油,分裝小瓶,低溫保存。
表 戊二醛法與過碘酸鈉法比較
比較項目
 
戊二醛法 過碘酸鈉法
 
一步法 二步法
標記方法 簡單 較復雜 較復雜
酶利用率 2~4% 2~4% 70%酶偶聯到99%抗體上
產率 <5% <5% >50%
標記抗體分子量 750萬 <25萬 >40萬
穿入組織能力 一般
抗體活性丟失 較多
酶活性丟失 較多
染色效應 較好 較好
3.二馬來酰亞胺法 二馬來酰亞胺(Dimaleimide)能與蛋白質半胱氨酸的硫基反應。首先用α-巰基乙胺還原蛋白質(IgG),并用N、N‘-O-苯二馬來酰亞胺活化,然后除去多余的試劑,最后使含二馬來酰IgG與含硫基的β-半乳糖苷酶連接。具體操作如下:將抗lgG抗體溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸鈉緩沖液并對同一緩沖液透析平衡過夜,離心除去不溶性物質,抗IgG(14mg/2ml)與10mlα-巰基乙胺在37℃溫育90min。過Sephadex后濃縮使每ml含3.0mg左右的還原抗IgG。在0℃中,按1︰1滴加飽和N、、N‘-O-苯二馬來酰亞胺溶液,混合,于30℃溫育20min,過SephadexG25柱,除去未反應的二馬來酰亞胺。收集二馬來酰亞胺“活化”的抗IgG,濃縮使濃度為OD280nm=1.0(光徑1cm),取1ml溶液加20μl(5mg/ml)β-半乳糖苷酶,置30℃20min,用0.10Mol/L NaOH中和后,于4℃置24h~72h,再過Sepharose-6B柱(1.5×40cm),以pH7.0PBS洗脫,收集酶結合物,加疊氮鈉(NaN3)防腐,4℃保存備用。
(一)   酶標抗體結合物的純化 
在酶標記的溶液中,出現的是各種交聯物的混合物,有酶-抗體、酶-抗體-酶、抗體-抗體、酶-酶,甚至還有游離的酶和抗體。在這中間,除了抗體-酶和酶-抗體-酶外,其它都應該給予除去。 
1.50%飽和硫酸銨沉淀法。 此法只能除去游離的酶及酶-酶聚合體。而不能除去其它不需要者。但是此法對酶標抗體的損耗少。 
2.過SephadexG200或Sepharose-6B柱。此法較繁瑣,而且對酶標抗體的損耗較大,但提純的質量好。 
(三)酶標抗體的鑒定
1.酶標抗體的活性鑒定 一般以瓊脂擴散和免疫電泳進行鑒定。使酶標抗體和相應的抗原(抗原濃度為1mg/ml)產生沉淀線,洗滌后于底物溶液中顯色,顯色后用生理鹽水漂洗,沉淀線不褪色,說明酶和抗體都具有活性。良好的酶標結合物瓊脂擴散滴度一般應在1:16以上。 
2.酶結合物的定量測定 包括酶量、IgG含量、酶與IgG克分子比值以及結合率的測定。
酶量(µg/ml)=OD403nm×0.42     
(1)戊二醛法:IgG(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62 
(OD403×0.42為酶在403nm的光密度,抗體與酶-戊二醛結合后OD280nm約增加6%,所以乘以0.94校正。由于兔IgGOD280nm=1.0時為0.62mg,所以又乘以0.62)。 
(2)過碘酸鈉法:IgG(mg/ml)=(OD280-OD403×0.30)×0.62
\
(40 000和160 000分別為辣根過氧化物酶和IgG的分子量)。
⑷ 酶結合率=結合物中的酶量/標記時加入的酶量×100%。
⑸ 酶標記率:OD403nm/OD280nm即酶中正鐵血紅素輔基的吸光度(403nm)與抗體-酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表示HRP在AbE中所占的比例,它與E/Ab克分子比值呈高度正相關。
3.酶結合物的質量標準 純化的酶結合物的質量標準應包括以下幾個方面。
(1)酶的催化活性。
(2)免疫學活性。 
(3)未聯接的游離酶的量。
(4)未聯接的原始免疫反應物的量。
(5)每個酶分子所聯接的免疫反應物分子數目。 
(6)生化性質。
(7)酶標記免疫試驗效果。
酶結合物的質量差異,可引起試驗敏感度的很大變化。例如用不同的程序制得的HRP-IgG結合物進行酶標記免疫試驗,可得到不同的試驗結果,故應予重視。
            表 用于ELISA酶標抗體的各項指標參數
評價 最好 一般
酶結合量(mg/ml)  ≥1.0 ≥0.5 0.4
酶結合率(%) >30  9~10 7
酶IgG克分子比 >1.5 1.0 0.7
(五)酶標抗體的保存
分裝小瓶,凍干低溫保存。也可分裝小瓶,在4℃或0℃以下保存。加甘油或牛血清白蛋白(最后濃度為33%)保存更好。避免反復凍融。保存期:一般1~2年活性不變。
 
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