| （一）酶標抗體的條件
1．純度高、含雜蛋白少,用IgG優于血清抗體，用Fab優于IgG。
2．特異性強 即抗IgG與IgG在免疫電泳上只有一條沉淀線,與IgG的全血清也只有一條沉淀線,這才算是特異性的單價抗體。
3．效價高 一般瓊脂擴散鑒定為1︰64以上才算合格。
（二）酶標記方法
1．交聯法 交聯法通常用的交聯劑是戊二醛，戊二醛商品大多為25%的水溶液，利用戊二醛分子上對稱的兩個醛基，分別與酶和蛋白質分子中游離的氨基、酚基等以共價鍵結合而進行標記。標記時應盡量采用新鮮純品，當戌二醛的OD235nm/OD280nm＜3時，即為好的交聯劑。
戊二醛交聯法又分為一步法和二步法。
⑴ 一步法：即把酶、戊二醛和抗體一起加入進行交聯。然后透析出過量的戊二醛而制備出具有高分子量的酶結合物。由于抗體分子量大(16萬)，酶分子量小(4萬),抗體分子的氨基數比酶蛋白分子氨基數多得多，結果生成的抗體－戊二醛或抗體－戊二醛－抗體多而造成酶標物的活性小。一步法操作：①抗IgG－AKP的制備：將10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中緩緩攪拌，盡量避免氣泡產生，完全溶解后，緩緩滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最終濃度為0.2%，移至室溫中靜置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去過量的戊二醛，4℃保存備用(也可保存于50%甘油中置低溫冰箱)；②抗IgG－HRP的制備：將12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,緩慢攪拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室溫2h~3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分裝后保存于低溫冰箱，避免反復凍融。或冷凍干燥保存。
⑵ 二步法：是先使酶與戊二醛反應,除去未反應的戊二醛，再使已“活化”的酶分子與抗體分子的氨基結合，最后加入少量的賴氨酸封閉被戊二醛激活的酶的殘基。二步法操作：將10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室溫放置18h，充分透析或以SephadexG25柱除去未反應的戊二醛。加生理鹽水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗體溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液，混合后4℃冰箱放置24h，加入0.1ml 0.2mol/L賴氨酸，置室溫2h，以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析，離心去沉淀，上清液即為酶結合物，再進一步以硫酸銨沉淀純化后應用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。
改良HRP二步標記法：取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液中，加入25%戊二醛0.1ml，37℃溫育2h后加入冰冷的分析純的無水乙醇2ml，2 500r/min離心沉淀10min~15min，傾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混懸，同上離心，傾去乙醇，將管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液溶解，加入0.5ml~1ml 抗IgG抗體溶液(含抗體15mg左右)，放在冰箱內過夜后，加KH2 PO4，使近中性即可應用。
2．氧化法 采用過碘酸鈉，過碘酸鈉是強氧化劑，能將HRP的甘露糖部分(與酶活性無關的部分)的羥基氧化成醛基，然后與抗體的氨基結合,形成酶標抗體。
（1）氧化法操作過程如下：將5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸鈉中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)無水乙醇溶液,在室溫中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L過碘酸鈉(NaIO4)，置室溫中輕攪30min，在溶液呈黃綠色時，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室溫中放置1h，使氧化反應中止，然后在4℃中對0.10Mol/L pH 9.5重碳酸鈉緩沖液透析，換液3次。在3ml HRP－醛基溶液中，加入5mg(溶于1ml的碳酸鹽緩沖液中)，室溫置2h~3h，加入5mg氫化硼鈉(NaBH4)，于4℃冰箱放置3h或過夜，然后用PBS液充分透析，離心去沉淀物。上清液即為酶結合物，純化后使用。
（2）改良過碘酸鈉法：①取5mg HRP溶于0.5ml雙餾水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml雙餾水＋128mg NaIO4) 0.5ml，混勻，置4℃30min；② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室溫放置30min；③加入含5mg純化抗體的水溶液1ml，混勻，并裝入透析袋，對0.05Mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌透析6h(或過夜)，使之結合；④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混勻，置4℃2h；⑤在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻，4℃30min，離心，去上清，沉淀以少許0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，裝入透析袋，以同樣液體在4℃透析除鹽過夜；⑥次日取出離心，以除去不溶物，即得酶－抗體(HRP－IgG)結合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml；⑦效價測定合格后，加入等量優質甘油，分裝小瓶，低溫保存。
表 戊二醛法與過碘酸鈉法比較
比較項目
|
戊二醛法 |
過碘酸鈉法
|
| 一步法 |
二步法 |
| 標記方法 |
簡單 |
較復雜 |
較復雜 |
| 酶利用率 |
2～4% |
2～4% |
70%酶偶聯到99%抗體上 |
| 產率 |
＜5% |
＜5% |
＞50% |
| 標記抗體分子量 |
750萬 |
＜25萬 |
＞40萬 |
| 穿入組織能力 |
差 |
好 |
一般 |
| 抗體活性丟失 |
多 |
少 |
較多 |
| 酶活性丟失 |
多 |
少 |
較多 |
| 染色效應 |
差 |
較好 |
較好 |
3．二馬來酰亞胺法 二馬來酰亞胺(Dimaleimide)能與蛋白質半胱氨酸的硫基反應。首先用α－巰基乙胺還原蛋白質(IgG),并用N、N‘－Ｏ－苯二馬來酰亞胺活化，然后除去多余的試劑，最后使含二馬來酰IgG與含硫基的β－半乳糖苷酶連接。具體操作如下：將抗lgG抗體溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸鈉緩沖液并對同一緩沖液透析平衡過夜,離心除去不溶性物質,抗IgG(14mg/2ml)與10mlα－巰基乙胺在37℃溫育90min。過Sephadex后濃縮使每ml含3.0mg左右的還原抗IgG。在0℃中,按1︰1滴加飽和N、、N‘－O－苯二馬來酰亞胺溶液，混合，于30℃溫育20min，過SephadexG25柱，除去未反應的二馬來酰亞胺。收集二馬來酰亞胺“活化”的抗IgG,濃縮使濃度為OD280nm=1.0(光徑1cm),取1ml溶液加20μl(5mg/ml)β－半乳糖苷酶，置30℃20min，用0.10Mol/L NaOH中和后，于4℃置24h~72h，再過Sepharose-6B柱(1.5×40cm)，以pH7.0PBS洗脫,收集酶結合物，加疊氮鈉(NaN3)防腐，4℃保存備用。
（一） 酶標抗體結合物的純化
在酶標記的溶液中，出現的是各種交聯物的混合物,有酶－抗體、酶－抗體－酶、抗體－抗體、酶－酶，甚至還有游離的酶和抗體。在這中間,除了抗體－酶和酶－抗體－酶外,其它都應該給予除去。
1．50%飽和硫酸銨沉淀法。 此法只能除去游離的酶及酶－酶聚合體。而不能除去其它不需要者。但是此法對酶標抗體的損耗少。
2．過SephadexG200或Sepharose－6B柱。此法較繁瑣,而且對酶標抗體的損耗較大,但提純的質量好。
（三）酶標抗體的鑒定
1．酶標抗體的活性鑒定 一般以瓊脂擴散和免疫電泳進行鑒定。使酶標抗體和相應的抗原(抗原濃度為1mg/ml)產生沉淀線,洗滌后于底物溶液中顯色,顯色后用生理鹽水漂洗,沉淀線不褪色,說明酶和抗體都具有活性。良好的酶標結合物瓊脂擴散滴度一般應在1：16以上。
2．酶結合物的定量測定 包括酶量、IgG含量、酶與IgG克分子比值以及結合率的測定。
酶量(µg/ml)=OD403nm×0.42
（1）戊二醛法：IgG(mg/ml)=(OD280nm－OD403nm×0.42)×0.94×0.62
(OD403×0.42為酶在403nm的光密度，抗體與酶－戊二醛結合后OD280nm約增加6%，所以乘以0.94校正。由于兔IgGOD280nm=1.0時為0.62mg，所以又乘以0.62)。
（2）過碘酸鈉法：IgG(mg/ml)=(OD280－OD403×0.30)×0.62
(40 000和160 000分別為辣根過氧化物酶和IgG的分子量)。
⑷ 酶結合率=結合物中的酶量/標記時加入的酶量×100%。
⑸ 酶標記率：OD403nm/OD280nm即酶中正鐵血紅素輔基的吸光度(403nm)與抗體－酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表示HRP在AbE中所占的比例，它與E/Ab克分子比值呈高度正相關。
3．酶結合物的質量標準 純化的酶結合物的質量標準應包括以下幾個方面。
（1）酶的催化活性。
（2）免疫學活性。
（3）未聯接的游離酶的量。
（4）未聯接的原始免疫反應物的量。
（5）每個酶分子所聯接的免疫反應物分子數目。
（6）生化性質。
（7）酶標記免疫試驗效果。
酶結合物的質量差異,可引起試驗敏感度的很大變化。例如用不同的程序制得的HRP－IgG結合物進行酶標記免疫試驗，可得到不同的試驗結果，故應予重視。
表 用于ELISA酶標抗體的各項指標參數
| 評價 |
最好 |
好 |
一般 |
| 酶結合量(mg/ml) |
≥1.0 |
≥0.5 |
0.4 |
| 酶結合率(%) |
＞30 |
9～10 |
7 |
| 酶IgG克分子比 |
＞1.5 |
1.0 |
0.7 |
（五）酶標抗體的保存
分裝小瓶，凍干低溫保存。也可分裝小瓶,在4℃或0℃以下保存。加甘油或牛血清白蛋白(最后濃度為33%)保存更好。避免反復凍融。保存期：一般1～2年活性不變。 |
