問：產(chǎn)品說明書中給出的膠乳粒徑是平均粒徑嗎？
答：產(chǎn)品說明書中給出的膠乳粒徑（Diameter）是平均粒徑。
問：如何選擇膠乳微球的粒徑？
答：一般選擇粒徑小的膠乳微球，則需要的抗體量就多，精密度和線性相對(duì)較好，而選擇粒徑大的膠乳微球性，則所需抗體少，精密度和線性相對(duì)較差，相對(duì)于小球，大球的靈敏度較好。
問：一般情況下我們所使用的微球的濃度大概是多少？
答：整個(gè)測定體系中，微球的濃度大約在0.01%左右，當(dāng)然這與試劑本身規(guī)定的線性有關(guān)系。
問：在使用離心方法偶聯(lián)乳膠微球，一般需要多大的（相對(duì)）離心力？
答：需要多大的離心力和所使用的乳膠微球有關(guān)，一般70nm左右的微球大概13000g/min 30min以上，粒徑越小所需時(shí)間越長，離心力越大。
問：蛋白（抗體）與微球偶聯(lián)前，是不是微球的活化時(shí)間越長，效率越好？
答：羧基微球的活化所需時(shí)間很短，一般以10-20分鐘為宜，長時(shí)間的活化反而會(huì)降低偶聯(lián)效率。
問：由于抗體不只是FC的氨基酸上有NH2，是不是表示它可以在任何方向與EDCA活化微球偶聯(lián)呢？如果是這樣，是不是會(huì)影響抗體與抗原的特異性反應(yīng)？
答： 事實(shí)的確如此，當(dāng)然由于抗體的空間折疊方式和FC端疏水性強(qiáng)，因此偶聯(lián)反應(yīng)的絕大多數(shù)發(fā)生在Fc端，對(duì)抗體與抗原的結(jié)合的影響不大。
問：膠乳微球與抗體偶聯(lián)后，當(dāng)時(shí)沒發(fā)現(xiàn)有凝集，但隔夜后發(fā)現(xiàn)有凝集，這是什么原因？如何控制和避免？
答：這種情況一般是偶聯(lián)效率低的原因。當(dāng)體系中蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交聯(lián)后還空出許多反應(yīng)基團(tuán)時(shí)，這些基團(tuán)又可以與相連微球上的蛋白反應(yīng)，結(jié)果是把球又拉在一起了，所以有聚集。可以加一些阻斷劑 解決,常見的是BSA，另外，也可提高微球的交聯(lián)率。但為什么是過一段時(shí)間后才出現(xiàn)凝集呢，這是因?yàn)槲⑶蚺悸?lián)上蛋白后，相互之間由于攜帶同種電荷的關(guān)系，比較穩(wěn)定（所以能以膠體樣存在），只有當(dāng)偶爾相互碰撞，遇上彼此的反應(yīng)基團(tuán)時(shí)才能結(jié)合。
3、膠乳的自凝現(xiàn)象如何控制和避免？
答：膠乳自凝與許多因素有關(guān)，如高電解質(zhì)濃度、表面價(jià)電荷被中和、或置于某些不利環(huán)境如冷凍時(shí)。如果電解質(zhì)濃度升高到某一水平，使得表面的價(jià)負(fù)荷被掩蔽，膠乳微球之間發(fā)生接觸，于是便產(chǎn)生凝集，故高離子強(qiáng)度的緩沖溶液不應(yīng)使用，緩沖溶液的的濃度不要超過50mM，但有些CML膠乳微球具有高電荷密度，則也能夠耐受較高的離子強(qiáng)度。對(duì)負(fù)電荷膠乳微球，不能使用陽電荷的緩沖溶液如Tris緩沖溶液，因?yàn)槟苁闺姾芍泻投Ｔ陂L期貯藏時(shí)，懸浮介質(zhì)的pH值應(yīng)至少保持在比膠乳微球表面基團(tuán)的pKa值高1-2pH單位。高濃度的膠乳微球容易促使膠體不穩(wěn)定，故膠乳微球的濃度盡量以低濃度為宜，膠乳微球也不能受冷凍，否則會(huì)凝集。
問：抗體偶聯(lián)至羧基微球后，即時(shí)檢測效果很好，但置于37度 2天后，抗體活性似乎下降很大，什么原因？
答：這種情況大概是以下情況所致：一、乳膠微球含有表面活性劑，導(dǎo)致膠乳自身出現(xiàn)自凝現(xiàn)象，可以通過顯微鏡進(jìn)行觀察，如果是膠乳含有活性劑，則在偶聯(lián)之前進(jìn)行清洗，保證偶聯(lián)的膠乳微球沒有聚集。二、如果共價(jià)結(jié)合反應(yīng)是成功的而抗體活性失活如此迅速，最常見的原因是抗體質(zhì)量差或試劑過期所致，而且還會(huì)出現(xiàn)一個(gè)自由流動(dòng)白色粉末、持續(xù)性團(tuán)塊等，這表表明試劑已被污染。
問：膠乳溶液用什么緩沖液多大離子強(qiáng)度保存穩(wěn)定性最好？
答：一般常用的是低濃度的Goods緩沖液，如MOPSO、MES、HEPES等緩沖液，濃度在25-50mmol/L。
問：膠乳微球偶聯(lián)抗體后與抗原進(jìn)行反應(yīng)，但是反應(yīng)不明顯，是什么原因所致？
答：⑴抗原和抗體不匹配；⑵包被的抗體量下足；⑶抗體使用量雖多，但偶聯(lián)效率低。
問：如何選擇膠乳試劑的波長？
答：膠乳試劑隨著檢測波長的增加吸光度降低，為了保證試劑檢測過程中不超過吸光度的檢測限，一般膠乳試劑的波長選擇在546-600nm左右。
微球表面基團(tuán)種類及其反應(yīng)
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微球表面基團(tuán) |
活化劑 |
與之反應(yīng)之基團(tuán) |
生成化學(xué)鍵類型 |
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羧基 |
EDC；EDC/(sulfo)NHS；
CDI；CMPI |
伯氨；仲氨 |
酰胺；仲胺 |
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氨基 |
交聯(lián)劑
硼氫化氰 |
羥基琥珀酰亞胺酯；醛基
鹵乙酰基；氯甲基酯 |
酰胺；仲胺或叔胺 |
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酰肼 |
交聯(lián)劑
硼氫化氰 |
羥基琥珀酰亞胺酯
醛基 |
二酰基肼
還原型腙 |
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環(huán)氧基 |
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氨基；巰基；羥基 |
仲胺；硫醚；醚 |
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醛基 |
硼氫化氰；苯胺 |
酰肼；肼；氨氧基 |
腙；腙；肟 |
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巰基 |
交聯(lián)劑；四硫磺酸鈉
4,4'-聯(lián)吡啶二硫醚 |
馬來酰亞胺；鹵乙酰基；二硫吡啶；；環(huán)氧基；羥基琥珀酰亞胺酯；乙烯砜 |
硫醚；硫醚；二硫化物
二硫化物；硫醚；硫醚
硫醚 |
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羥基 |
CDI；對(duì)甲苯磺酰氯
溴化氰；DSC
雙環(huán)氧基化合物 |
氨基；巰基；羥基 |
胺；仲胺；硫醚；醚 |
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金屬基 |
硫醇或二硫醇 |
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硅羥基 |
硅烷 |
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共價(jià)結(jié)合膠乳微球的參考方法（以下內(nèi)容均為國外文獻(xiàn)翻譯過來的）
A. 一步法
1. 配制50 mM 的MES反應(yīng)緩沖溶液，pH值為6.0；
2. 將蛋白質(zhì)溶解于反應(yīng)緩沖溶液中，其濃度為10mg/ml；
3. 用反應(yīng)緩沖溶液稀釋膠乳微球，使其濃度為1%（W/V）；
4. 將上述蛋白質(zhì)溶液與膠乳微球混和，混和后在室溫培育20分鐘；
5. 用去離子水配制EDAC溶液，濃度為10 mg/ml（52μmol/ml）；
6. 取計(jì)算量的EDAC溶液加到蛋白質(zhì)與膠乳微球混合液中；
7. 用0.1 M氫氧化鈉（NaOH）溶液調(diào)整該反應(yīng)混合液的pH值至 6.5±0.2，在搖床室溫培育2小時(shí)；
8. 將未結(jié)合的蛋白質(zhì)除去，貯藏于緩沖溶液中。
B. 二步法
簡單二步法
1. 用反應(yīng)緩沖溶液稀釋膠乳微球，使其濃度為1%（W/V）；
2.1ml膠乳微球懸浮液，加入20 mg EDAC，在室溫培育40分鐘，在20分鐘后第二次加入20 mg/ml；
3.用相等體積的該緩沖溶液來洗滌膠乳微球，離心，用1倍體積的緩沖溶液重復(fù)處理；
4.將蛋白質(zhì)溶解于50-100mM的MES緩沖溶液中，蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml；
5.再將膠乳微球懸浮于去離子水或結(jié)合的緩沖溶液中，迅速加入溶解的蛋白質(zhì)，37℃攪拌反應(yīng)3小時(shí)；
6.按1ml反應(yīng)混合液加入2.5 μl乙醇胺混合，攪拌反應(yīng)10分鐘；
7.除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，貯藏與貯存的緩沖溶液中。
生成NHS-酯的中間體二步法
1.每ml反應(yīng)混合物加入下列各物：
a.去離子水是最后容積為1.0 ml；
b.0.1 ml的10x的貯備緩沖溶液，其pH值為6.0-6.5（一般可用0.5 M MES緩沖溶液）；
膠乳微球最終濃度為1%（W/V）；
c.0.23 ml的50 mg/ml 的NHS在去離子水中的溶液；
d.19.2 mg/ml (100 mM)的EDAC在去離子水中的溶液（注5、6）；
2.在室溫將此混合物反應(yīng)15-30分鐘，不斷攪拌；
3.用MES緩沖液或純化水洗滌膠乳微球懸浮物，除去未反應(yīng)的NHS和EDAC；
4.重新將膠乳微球在去離子水中懸浮，使其濃度為1%（w/v）；
5.將結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于50-100mM 的MES緩沖溶液中，濃度為1 mg/ml；
6.立即加入蛋白質(zhì)溶液（膠乳微球、蛋白質(zhì)和緩沖溶液的濃度分別為0.5%(w/v)、0.5 mg/ml、25-50 mM）；
7.將混合物反應(yīng)至少2小時(shí)，輕輕攪拌；
8. 按1ml反應(yīng)混合液加入2.5 μl乙醇胺混合，攪拌反應(yīng)10分鐘；
9.除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)和乙醇胺，貯與適宜的貯存緩沖溶液中。
C、蛋白質(zhì)與帶醛基的膠乳微球反應(yīng)
帶醛基的膠乳微球是疏水性的膠乳微球，能吸附并能與蛋白質(zhì)在中性pH條件下生成Schiff堿，這是脂肪族醛基與蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生的反應(yīng)（賴氨酸的伯胺）。這些膠乳微球不需事先活化而生成共價(jià)鏈。Schiff堿的生成是可逆反應(yīng)。此Schiff堿能被氰基氫硼化鈉（sodium cyanoborohydride）反應(yīng)還原至穩(wěn)定的烷基胺。當(dāng)肽類或其他有單一反應(yīng)氨基的分子與帶醛基的膠乳微球結(jié)合時(shí)，由于還原而趨向穩(wěn)定。
下面說明蛋白質(zhì)與帶醛基的膠乳微球結(jié)合的方法：
1. 配制50 mM的反應(yīng)緩沖溶液，pH值為7.0-7.5；
2. 配制10 mg/ml的蛋白質(zhì)在反應(yīng)緩沖溶液中的溶液；
3. 配制1%(w/v) 帶醛基膠乳微球在反應(yīng)緩沖溶液中的懸浮液；
4. 將1份蛋白質(zhì)溶液和10份膠乳微球懸浮液混和，在室溫反應(yīng)2小時(shí)；
5. 除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)；
6. 貯藏膠乳微球結(jié)和物與適宜的貯存緩沖溶液中。 |
